Microbiologie

La microbiologie est une sous-discipline de la biologie basée sur l'étude des micro-organismes.

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Discipline de la biologie - Microbiologie

La microbiologie est une sous-discipline de la biologie basée sur l'étude des micro-organismes.

Les micro-organismes forment un groupe extrêmement diversifié d'organismes microscopiques, unicellulaires et répartis dans les trois domaines du vivant (bactérie, archée et eucaryote). Ils se distinguent les uns des autres par leur forme, leur taille et leur mode de vie.

Les virus, incapables de se reproduire sans détourner la machinerie cellulaire d'un autre organisme, ne sont pas reconnus par l'ensemble des spécialistes comme vivants. La microbiologie étudie quelquefois leurs actions sur les micro-organismes mais n'a pas pour but de les étudier comme entités. Cette étude est réalisée dans une autre discipline de la biologie : la virologie.

On parle aussi désormais de «microbiologie moléculaire», dans le domaine des biotechnologies surtout[1].

Historique

Classification

L'analyse de l'anatomie des différents micro-organismes recensés a permis de les classer en deux grands groupes : les procaryotes (munis d'un proto-noyau) et les eucaryotes (possédant un vrai noyau)

Des analyses génétiques ou prouvé que les archæa sont aussi différentes des eubactéries que des eucaryotes d'un point de vue phylogénétique, mais on ignore toujours quel a été le point de départ de la différenciation de ces trois groupes.

Caractéristiques

Les procaryotes

Les procaryotes Prokaryota ou Prokarya), du grec pro (avant) et caryon (noyau) , sont des organismes dont la cellule ne possède pas de noyau cellulaire ni d'autres organites, ils appartiennent à au moins deux taxons différents :

Ces micro-organismes ont des mécanismes pour résister à ces conditions.

Autres règnes

La systématique moderne phylogénétique amène à reclasser parmi les procaryotes des espèces jadis classées dans le règne animal, végétal, ou même fongique (normalement des espèces toutes eucaryotes selon la classification moderne du vivant).

De plus, les espèces eucaryotes multicellulaires (végétales comme animales) ne peuvent vivre sans la présence de certaines bactéries dans le milieu intercellulaire ou dans des organes cavitaires : elles participent à la synthèse (surtout chez les plantes fourragères qui utilisent des bactéries de la famille Rhizobium pour la synthèse et l'assimilation de l'azote) ou la dégradation (par exemple pour la digestion) de certains composés organiques ainsi qu'à la lutte active contre d'autres espèces bactériennes ou virales (pathogènes à cause de leur développement anarchique non symbiotique).

De même la microbiologie s'intéresse de plus en plus aux «espèces» pseudo-cellulaires (organites) présentes dans le noyau ou le cytoplasme de l'ensemble des eucaryotes et la plupart de procaryotes, où ils «vivent» en symbiose endogène (endocytose), et sert à penser que leur origine est celle des archéobactéries ou d'espèces toujours plus anciennes.

Ce mode de colonisation des êtres cellulaires eucaryotes ou procaryotes est proche de celle utilisée dans un autre domaine du vivant, les virus, toujours classés dans aucun règne, actuellement étudiés activement par la virologie moderne, en particulier pour les besoins de la médecine (traitements antiviraux, ou thérapie génique), mais également en botanique et zoologie pour les besoins agricoles (organismes génétiquement modifiés). Occasionnellemen, des bactéries sont utilisées comme vecteurs de culture et de transport de ces virus (fréquemment aussi génétiquement modifiés) chargés d'opérer les modifications génétiques cellulaires.

L'étude principale des procaryotes est principale par conséquent pour comprendre l'évolution de l'ensemble des autres espèces des cinq règnes classiques et s'appuie aussi désormais sur la recherche plus récente en virologie et biologie moléculaire.

Les eucaryotes

Les eucaryotes ont un dispositif membranaire interne enfermant des organites (noyau, plaste, mitochondrie... )  ; ils présentent un cytosquelette interne (actine, tubuline) absent chez les procaryotes, qui leur confère une taille fréquemment plus importante que les procaryotes.

On estime que chaque groupe d'eucaryotes a eu un ancêtre parmi les procaryotes (archéobactéries ou eubactéries), et que les mitochondries (et peut-être aussi d'autres organites comme les chloroplastes) présents dans le noyau des eucaryotes actuels ont aussi eu au moins un ancêtre procaryote différent qui aurait colonisé cette ancienne bactérie pour vivre en symbiose (endosymbiose) avec elle et former l'ensemble des eucaryotes qui ne peuvent plus vivre sans elles.

En effet, on retrouve dans les mitochondries un cytosquelette interne spécifique, une structure membranaire externe complexe, un matériel génétique interne spécifique logé dans une zone plasmique nommée proto-noyau (dépourvu de membrane mais tout de même structurée), même si les mitochondries ne peuvent se multiplier seules sans le concours de la cellule hôte (les mitochondries auraient perdu leurs facultés de reproduction qui ne leur étaient plus nécessaires, puisque la cellule hôte leur apporte quasiment tout le matériel indispensable à leur croissance et leur division).

Algues

Contrairement aux champignons ainsi qu'aux protozoaires, les algues ont des pigments chlorophylliens leur servant à réaliser la photosynthèse.

Elles sont par conséquent des organismes vivant immobile et autotrophes.

Les algues sont présentes dans le sol, les plantes, l'eau douce et l'eau de mer.

Champignon

Les champignons sont présents dans le sol, plantes, débris végétaux, lichen, parasites de l'homme, des animaux et des plantes.

Remarque : une levure, eucaryote unicellulaire, est un champignon. Il existe de nombreuses espèces de levures comme Saccharomyces cerevisiæ (levure de boulangerie), la famille des Candida (responsables des candidoses), Rhodotorula (quelquefois retrouvée dans la choucroute qu'elle colore en rouge), Schizosaccharomyces, etc.

Les champignons sont "absorbotrophes" : ils se nourrissent par absorption. Ils sécrètent des enzymes qui digèrent des polymères dans le milieu extérieur, ce mécanisme chimique transforme par exemple les glucides en monomères (petites molécules) qui sont ainsi absorbés.

Protozoaire

Les protozoaires sont des êtres unicellulaires dépourvus de paroi cellulaire (contrairement aux algues). On en trouve dans le sol, l'eau douce, l'eau de mer, mais également comme parasites de l'homme et des animaux. Les protozoaires se nourrissent par pinocytose et endocytose car ils n'ont pas de paroi cellulaire.

Autres règnes

Bien que non classés parmi les microbes, les règnes végétaux (avec affinité avec les algues) et animaux (avec affinité avec les protozoaires) sont aussi classés parmi des eucaryotes. Ils ne sont pas classés comme micro-organismes car ils ne vivent pas ni ne se reproduisent à l'état unicellulaire.

La taille des micro-organismes

Comme signalé au début, les micro-organismes sont de très petite taille (d'où leur nom)  :

Le rapport surface sur volume est directement influencé par la taille : si on considère une forme simple telle que la sphère, la surface est proportionnelle au carré de la taille (4πr² si r est le rayon de la sphère), tandis que le volume est proportionnel au cube de la taille (4/3πr³), le rapport surface/volume est par conséquent inversement proportionnel à r (3/r).

Ceci conditionne la vitesse à laquelle le micro-organisme se nourrit : la nourriture passe à travers la membrane plasmique, par conséquent la vitesse d'absorption est proportionnelle à la surface, mais la quantité à nourrir est proportionnelle au volume. La vitesse à laquelle entrent et sortent les nutriments et les déchets est par conséquent inversement proportionnelle à la taille. Par conséquent plus la bactérie est petite, plus elle va pouvoir se nourrir à grande vitesse. Elle compense sa petite taille par une multiplication à particulièrement grande vitesse (taux de croissance particulièrement rapide).

La culture des micro-organismes

Richesse du milieu

Les micro-organismes ont besoin :

C, H, O, N, S, Na, Mg, P, K

Les éléments carbone, azote, phosphore doivent être présents aux proportions 100/10/1 pour un milieu correct.

Cu, Co, Zn, Cl, Fe...
D'origine minérale (sel d'ammonium)
Vitamines, acides aminés
Pour les aérobies strictes
— ou —
d'absence de dioxygène (ou oxygène moléculaire) anaérobies stricts; pour ces micro-organismes, le peroxyde d'oxygène (H2O2) constitué par la réaction entre l'O2 et l'H2O les empoisonnent, car ils ne possèdent pas une catalase dégradant H2O2 à l'inverse des individus aérobies.

Il existe aussi des micro-organismes aérobies facultatifs capables de se multiplier en présence ou en l'absence d'oxygène grâce à leur capacité à utiliser la fermentation et des bactéries microaérophiles qui ne se développent qu'à une certaine pression en dioxygène.

Diversité du milieu de culture

On peut distinguer deux sortes de milieux de culture :

et parmi ces 2 types de milieux, il existe des milieux sélectifs (qui vont permettre de sélectionner le type de micro-organismes qui pourront s'y multiplier). On peut ainsi choisir de ne laisser se développer qu'un genre de bactérie donné (ex : milieu mFC pour les coliformes fécaux ou gélose au sang pour certains pathogènes) ou au contraire de faciliter le développement des levures-moisissures en ajoutant un antibiotique au milieu. La température à laquelle on incubera les milieux inoculés forme aussi un facteur de sélection comme mentionné plus haut.

Les milieux de culture peuvent contenir des extraits de levure (cellules de levure déshydratées et lysées) qui fournissent une source d'acides aminés, de vitamines et d'azote, des extraits de malt apportant une source de carbone, des peptones (protéines animales, de poisson, de caséine de lait) source d'azote organique qui intéresse les individus hétérotrophes.

Ces milieux sont soit liquides, soit solides. Pour solidifier le milieu on utilise souvent la gélose ou agar-agar, un polymère de sucre tiré d'une algue rouge présentant la propriété de former avec l'eau un gel solide si la température est inférieure à 60°C.

La stérilisation

La stérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un objet et ce, de manière durable. En microbiologie, l'objectif de la stérilisation est d'une part maîtriser les micro-organismes introduits dans le milieu d'étude, et d'autre part éviter la contamination du milieu extérieur et des personnes (voir aussi l'article sur l'hygiène).

Il existe trois façons pour stériliser un milieu de culture. Une destruction par la chaleur, par une méthode de filtration ou par l'emploi de radiation et d'agent chimique (gaz)

La chaleur

On peut distinguer les procédés à chaleur «sèche» ou «humide».

Figure 1 : Zone de stérilité d'un bec Bunsen.

Cas spécifiques : la pasteurisation et tyndallisation

La pasteurisation est un procédé pour la conservation des aliments par lequel un aliment est chauffé à une température définie pendant une période de temps définie avant d'être refroidi rapidement. Les températures de pasteurisation fluctuent entre 70 °C et 85 °C. Cette technique ne détruit qu'une partie de la flore bactérienne. Ce n'est , en aucun cas, une technique de stérilisation.

La tyndallisation est une série de chauffages brefs à des températures de 70°C à intervalles réguliers (3 chauffages d'une heure, 24 h entre 2 chauffages), ceci pour laisser aux formes résistantes la possibilité de germer pour les tuer au chauffage suivant. A titre d'exemple, la destruction des germes pathogènes du lait se fait par un cycle de 63°C pendant 30 minutes suivie de 73°C pendant 15 minutes.

L'ébullition n'est pas une méthode de stérilisation. Les formes sporulées des bactéries peuvent résister jusqu'à 8h30 à 100°C.

La filtration

La filtration est une technique qui consiste à faire passer un liquide à travers un filtre dont les pores ont un diamètre de 0, 2 µm ; les micro-organismes sont trop gros pour passer et sont par conséquent retenus par le filtre. Pour forcer ce liquide à traverser le filtre on utilise deux solutions :

Cette technique est intéressante lors d'utilisation de produits thermolabiles (c'est-à-dire qui ne résistent pas à la chaleur) comme certains acides aminés aromatiques, vitamines, hormones de croissance, acides nucléiques et une bonne partie des antibiotiques. Cependant les filtres de 0.2 µm colmatent vite. On peut contourner ce problème en augmentant la surface du filtre ou en utilisant un procédé de filtration tangentielle.

Occasionnellemen le filtre ayant servi à stopper les micro-organismes peut être déposé sur un milieu de culture solide pour permettre la multiplication des germes, ceci dans l'objectif de procéder à leur dénombrement ainsi qu'à leur identification.

Radiation et agent chimique

Ces techniques sont utilisées par les industries dont l'alimentaire. Elles sont particulièrement pénétrantes car les radiations et certains gaz traversent le plastique et tuent les micro-organismes.

Les rayons ultraviolets ne sont cependant pas une bonne technique de stérilisation car ils sont non pénétrants, par conséquent ils ne passent pas au travers de matériaux comme le plastique et le verre. Qui plus est certains micro-organismes sont capables de réparer les dommages infligés par les ultraviolets si le produit est éclairé après application de rayons ultraviolets; c'est le phénomène dit "de photo-réparation".

On peut occasionnellementutiliser le rayonnement gamma, bien plus pénétrant et puissant que les ultraviolets.

Notion de culture pure

Technique des stries

Elle est basée sur la notion d'UFC (Unité Formant une Colonie). Chaque unité cellulaire (une cellule, un groupe de cellules ou un morceau d'hyphe) va donner une colonie.

Sur un milieu de culture, il y a formation d'un monticule de bactéries ou de levures avec une forme spécifique (la colonie). La forme de ce monticule est déterminée par l'organisation de la colonie, qui elle-même est déterminée génétiquement. Les champignons vont, eux, développer un thalle c'est-à-dire ce qu'on peut par exemple observer sur les confitures ayant "moisi". L'UFC est utilisée aussi pour le dénombrement bactérien en utilisant des cultures sur boîte à partir de tubes préparés par dilutions en cascades de la suspension bactérienne mère.

L'observation macroscopique de l'aspect des colonies sert à différencier les colonies de bactéries contaminantes de celles qu'on cherche à isoler.

Technique de suspension dilution

Cette technique permet de évaluer le nombre de microorganismes qui se trouvent dans un milieu liquide (eau de puits, boissons, eau de piscine... ) ou dans un milieu solide (sol, aliments... ). Elle peut aussi servir à isoler une souche pure à partir d'un mélange.

Il s'agit simplement d'une suite de dilutions suivie d'un prélèvement d'un aliquot qui sera étalé sur un milieu de culture qui pourra être sélectif ou non. Il suffira ensuite de compter le nombre de colonies, et connaissant le volume de l'aliquot (en général 1 mL sur une boîte), on en déduira la quantité approximative de bactéries dans le milieu (on considère qu'1 UFC correspond à 1 bactérie).

Identification des bactéries

L'identification des bactéries se fait suivant une clé dichotomique qui va des caractères les plus vastes aux plus pointus pour aboutir à une espèce bactérienne donnée.

Critères morphologiques

L'étude de la morphologie bactérienne est le premier acte effectué par un laboratoire de diagnostic pour identifier une bactérie. L'observation de la morphologie bactérienne permet une orientation préliminaire du diagnostic.

Macroscopique

À l'œil nu, on peut distinguer les caractéristiques d'une colonie :

  • La forme du relief
  • La taille
  • La couleur
  • L'aspect (collant, filamenteux... )
  • L'odeur
  • La transparence
  • L'allure des contours

Il existe trois grands types de colonies :

Microscopique

Coloration de Gram

Les bactéries étant généralement presque transparentes, on débute par préparer un étalement sur lame de microscope auquel on applique une coloration de Gram. Les bactéries à Gram positif apparaîtront mauves tandis que celles à Gram négatif apparaîtront roses. Il existe d'autres colorations, comme par exemple celle au vert de malachite servant à mettre en évidence les formes sporulées. La coloration de Gram sert à déterminer le type de paroi cellulaire.

Forme

La forme est extrêmement diverse au sein du monde bactérien. Si on excepte les bactéries dépourvues de paroi (Mycoplasmes), qui peuvent être particulièrement polymorphes, la diversité est assez restreinte pour les bactéries d'intérêt médical et vétérinaire. Parmi celles-ci, on distingue essentiellement des formes sphériques (cocci), cylindriques (bacille), spiralées (spirille), enroulées (spirochète) à appendice bourgeonnante ou filamenteuse.

Mode de groupement

Elles peuvent se regrouper en chaînes (Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus... ), en amas asymétriques ou grappes (Staphylococcus), en amas cubiques réguliers (sarcines), en palissades ou en paquets d'épingles (Corynebacterium)... Le mode de groupement, à condition de l'apprécier sur une culture jeune effectuée en milieu liquide et de tenir compte de l'aspect prédominant, est aussi un élément important pour orienter l'identification.

Taille

Les plus petites bactéries ont une taille de 0, 1 à 0, 2 micromètre (Chlamydia) tandis que certaines ont un diamètre supérieur à 10 micromètres. La plus grande bactérie connue (Thiomargarita namibiensis) peut atteindre un diamètre de 750 micromètres.

Présence de spore

Toutes les bactéries n'ont pas la possibilité de sporuler. La totalité des bacilles à Gram + sporulent en situation de stress. Pour mettre en évidence les spores au microscope optique, il suffit de les colorer au vert de malachite ou à l'encre de chine. Mais on peut les deviner à la coloration de Gram (absence de coloration). Les spores sont présents chez les Bacillus.

Mobilité

Les bactéries peuvent être équipées d'un ou plusieurs flagelle (s) leur servant à se déplacer. Pour définir le mode de déplacement des bactéries, on parle de chimiotactisme. La bactérie évoluant dans un milieu se déplace selon des gradients de concentration pour se rapprocher de sa "nourriture"

Capsule

La capsule est constituée de polymères (polysaccharides ou protides) disposés en couches à la périphérie de la bactérie. Celle-ci autorise la bactérie d'adhérer aux surfaces (coloniser les surfaces) et d'échapper au dispositif immunitaire car les antigènes de surface sont recouverts par la capsule qui les rend indétectables (pouvoir pathogène).

Critères biochimiques

On identifie aussi une bactérie en observant si elle utilise tel ou tel substrat. On la met par conséquent en contact dans un milieu de culture avec un glucide, ou un peptide, ou d'autres substrats plus complexes. On peut révéler l'utilisation de ce substrat par virage (changement de couleur) d'un indicateur de pH car un glucide utilisé donne un produit acide, un peptide donne un produit basique, etc.

Chaque famille de bactéries a des caractères propres, on peut par conséquent les rassembler aisément avec des caractéristiques de base comme l'utilisation du glucose avec ou sans oxygène, la réduction des nitrates, etc. Par la suite, on dispose de galeries d'identifications biochimiques qui sont quelquefois vendues par des sociétés spécialisées. Ces tests sont assez longs, d'un à deux jours.

Critères génétiques

On peut citer des techniques de génie génétique comme :

Systématique bactérienne

La systématique permet d'identifier une souche bactérienne inconnue grâce à différents examens ainsi qu'à l'utilisation de milieux de culture spécifiques.

La coloration de Gram et les tests de la catalase et de l'oxydase permettent de déterminer la famille. Des milieux de cultures spécifiques permettent d'arriver au genre ainsi qu'à l'espèce. Des examens supplémentaires tels que le sérogroupage peuvent être utilisés occasionnellemen.

Coques à Gram positif et catalase positive

Coque à Gram positif et catalase négative

Coque à Gram négatif

Gram négatif regroupe les bactéries à paroi fine qui ne retienne pas le bleu de gentiane/cristal elle apparaisse au microscope optique en rose après qu'on ajoute de la fushine (genre neisseria, par exemple).

Bacille à Gram positif

Bacille à Gram négatif

Oxydase négative

Famille des Enterobacteriaceæ :

Oxydase positive

Les agents antibactériens

Les agents physiques

On peut citer les agents suivants :

Les agents chimiques

à suivre

Les antibiotiques

Les antibiotiques sont des substances chimiques qui ont une action spécifique avec le pouvoir de limiter la prolifération de bactéries spécifiques. Elles sont dépourvues de toxicité pour les autres cellules (champignons et autres eucaryotes). Ces molécules peuvent avoir une action drastique, c'est-à-dire bactéricide; leur efficacité peut être aussi limitée à empêcher le développement des bactéries (on parle alors d'action bactériostatique).

Voir l'article détaillé Antibiotique.

Les résistances aux antibiotiques

Voir l'article Antibiotique > Les résistances aux antibiotiques.

La croissance bactérienne

C'est le pouvoir ou la capacité des bactéries à augmenter leur nombre ; il est selon le type de bactéries (thermophyles / mésophyles / pscychrophyles / pscychrotrophes / etc. ) Lorsque des bactéries sont incubées dans un milieu liquide correct, elles continuent le plus souvent à se multiplier de façon exponentielle jusqu'à ce qu'un facteur indispensable à leur croissance approche de l'épuisement et devienne limitant ou que des produits métabolites inhibiteurs (acides organiques, alcools, ammoniaque, etc. ) s'accumulent exagérément. Cette culture, pratiquée sans addition de nutriment ni élimination de déchets en cours de croissance, se nomme une culture en milieu discontinu ou en batch qui forme un dispositif clos. Une culture de ce type se comporte comme un organisme multicellulaire avec une limitation de croissance génétiquement déterminée.

On peut représenter graphiquement la croissance d'une culture de ce type en portant le logarithme du nombre de cellules viables selon le temps. La courbe obtenue pourra être divisée en quatre phases : 1- phase de latence = x, 2- phase de croissance logarithmique de x à X, 3- phase stationnaire = X et 4- phase de décroissance exponentielle de X à 0.

Diauxie

Figure 4 : Courbe de croissance dans un milieu contenant deux glucides (par exemple : I : utilisation du glucose et II : utilisation du lactose).

En présence de deux sources de carbone, les bactéries exhibent une courbe de croissance biphasique. Ceci s'explique par la consommation de la source de carbone la plus aisément assimilable, puis une adaptation durant laquelle les enzymes servant à dégrader la seconde source de carbone sont synthetisées, puis consommation de la deuxieme source de carbone. L'analyse de ce comportement a permis à Jacques Monod de définir la notion d'opéron.

Voir aussi

Liens externes

Notes et références

  1. ↑ Accès vers un document de synthèse diffusé par ADIT (Voir p 11/29, article du Prof. Dr. Axel A. Brakhage intitulé «Les bioproduits pharmaceutiques» in «Les biotechnologies blanches, avancées et perspectives - Rencontre d'experts franco-allemande» Berlin, 29 septembre 2006)


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